Elisa實驗：酶聯免疫吸附測定類型與操作步驟

ELISA（酶聯免疫吸附測定）是將抗原抗體特異性反應與酶的高效催化作用結合的高靈敏度免疫檢測技術，目前已廣泛應用于醫學診斷、生物科研、食品檢測等多個領域。本生BUNSEN試劑盒

一、ELISA的測定類型

間接法?

原理?：先在固相載體上包被已知抗原，加入待檢樣本中的抗體后，再加入酶標記的二抗進行結合，最終通過顯色反應判定結果。

適用場景?：主要用于檢測樣本中的特異性抗體，比如HIV抗體篩查、疫苗免疫效價評估等場景。

特點?：通用性強，一種酶標二抗可適配多種一抗檢測，成本較低。

雙抗體夾心法?

原理?：使用一對配對的捕獲抗體和檢測抗體，將目標抗原夾在中間形成“抗體~抗原~抗體"的三明治結構，再通過后續顯色完成定量。

適用場景?：適合檢測具有2個以上抗原表位的大分子蛋白，比如細胞因子、腫瘤標志物等微量物質。

特點?：靈敏度高、特異性強，是目前應用的定量檢測類型。

競爭法?

原理?：樣本中的待測抗原和預先標記的已知抗原，競爭性結合固相載體上的有限抗體，最終顯色信號越弱代表樣本中目標抗原濃度越高。

適用場景?：專門用于檢測小分子抗原或半抗原，比如激素、獸藥殘留等無法形成雙抗體夾心的物質。

直接法?

原理?：將酶直接標記在一抗上，直接與包被的抗原結合后顯色，操作流程更短。

適用場景?：多用于重組蛋白活性驗證，目前常規檢測中使用占比較低。

二、ELISA通用標準操作步驟

包被?

將捕獲抗體或抗原用包被液稀釋至1——10μg/mL的工作濃度，每孔加入100μL，4℃過夜孵育12——16小時，或37℃孵育1——2小時，讓目標蛋白充分吸附在96孔板表面。

封閉?

每孔加入200——300μL的封閉液（1%——5% BSA或5%脫脂牛奶），室溫孵育1——2小時，封閉固相載體上未結合蛋白的空白位點，避免后續步驟出現非特異性吸附。

加樣孵育?

分別加入梯度濃度的標準品和待測樣本，每孔100μL，37℃條件下孵育1——2小時，讓樣本中的目標分子與包被物充分發生特異性結合。

洗滌?

倒掉孔內液體，每孔加入300μL PBST洗滌液，靜置30秒后甩掉液體并在吸水紙上拍干，重復3——5次，洗去所有未結合的游離物質。

加酶標抗體?

每孔加入100μL酶標記的檢測抗體或二抗，37℃孵育30分鐘——1小時，完成結合后再次重復3——5次洗滌操作，去除未結合的酶標抗體。

顯色與終止?

每孔加入100μL TMB底物溶液，室溫避光顯色15——30分鐘，觀察最高濃度標準品孔變為深藍色后，每孔加入50μL 2M硫酸終止液，此時藍色反應液會變為穩定的黃色。

讀數與結果分析?

加入終止液后的15——30分鐘內，使用酶標儀在450nm波長下讀取各孔的吸光度（OD值），通過標準品的濃度和對應OD值繪制標準曲線，最終計算出待測樣本中目標物質的實際濃度。

三、關鍵操作注意事項

洗滌操作必須充分，次數不足會導致背景值偏高，洗滌過度則會造成特異性信號減弱，需嚴格按照試劑盒說明書要求執行。

所有加樣步驟必須更換新的吸頭，避免樣本間交叉污染，試劑從冰箱取出后需恢復至室溫再使用，樣本禁止反復凍融。

實驗必須同步設置陽性對照、陰性對照和空白對照，待測樣本建議設置復孔，保證最終結果的準確性。

TMB底物溶液對光敏感，需避光保存和使用，顯色過程中需動態觀察顏色變化，精準把控終止時機。

注：以上資料僅供參考，不作為實際數據，實驗需嚴格遵循說明或咨詢技術老師。

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